eLife︱分选蛋白SNX27通过突触粘附蛋白LRFN2调节AMPA受体转运的新机制
撰文︱王培香
责编︱王思珍
内涵体网络（endosome network）在调节细胞表面功能方面发挥关键作用，而这一作用主要通过内吞蛋白的分选机制而实现，即被内吞的整合蛋白运可以被运送到溶酶体进行降解，也可以通过循环途径被运送到质膜进行再利用【1】。目前已经鉴定的分选蛋白包括nexins、retromer、retriever、以及WASH、CCC和ESCPE-1等复合物，这些分选蛋白的突变与神经系统疾病、神经功能紊乱、代谢异常和病原体感染密切相关。
nexin-27（简称SNX27）是分选蛋白家族nexin中的独特一员，该分子的氨基端含有一个PDZ结构域，因此其具有调节两种互斥性蛋白质的相互作用的双功能作用：它既可以与抑制性的retromer结合【2，3】，又可以与整合蛋白羧基端的PDZ结构域结合基序相结合【4-6】。通过这种相互作用，SNX27可以调节含包PDZ结构域结合基序的内吞整合蛋白依赖于retromer的恢复，也可以促进整合蛋白循环回到质膜上。
SNX27在调节AMPA受体的内涵体循环中发挥重要作用。目前的主流认为，SNX27介导的AMPA受体的分选依赖于AMPA羧基端的PDZ结合基序与SNX27的PDZ结构域的结合。然而Clairfeuille等人采用等温滴定量热法并没有检测到SNX27与AMPA受体亚基GluA1和GluA2的直接结合【7】。这些数据提示需要对SNX27介导的AMPA受体内涵体分选的分子细节进行重新考量。在唐氏综合征中SNX27表达的去调节可导致突触功能障碍。这进而提示鉴定依赖SNX27的神经元整合蛋白，将为SNX27相关病理的复杂病因提供见解。
近期，英国布里斯托尔大学的Kirsty J McMillan（文章一作）、Kevin A Wilkinson与Paul J Banks合作以Sorting nexin-27 regulates AMPA receptor trafficking through the synaptic adhesion protein LRFN2为题在eLife杂志上发表了最新研究，揭示了SNX27通过调控LRFN2分选从而间接控制AMPA受体介导的突触传递和可塑性的机制，并为了解SNX27和LRFN2在一系列神经疾病中的功能异常提供了见解。
首先，为了鉴定依赖SNX27进行运输的货物蛋白，通过无偏性蛋白质组学的方法，研究者们在大鼠原代皮质神经元中鉴定了212个可信度较高的与SNX27相互作用的蛋白。其中，有16个蛋白含有I型PDZ结合基序，该基序包括与SNX27高亲和力结合所需的最佳酸性氨基酸。而这16个中又有7个是整合蛋白，包括高亲和性谷氨酸转运体SLC1A3、碳酸氢钠共转运体SLC4A7、钠离子依赖性转运体LRFN2、外向整流钾通道KCNT2等。然而，有趣的是，这212个成员里并没有任何AMPA受体的亚基（包括GluA1和GluA2），这表明SNX27与GluA2之间存在弱、低丰度的关联，他们之间可能是间接的关联机制。
接着，为了验证这一设想，作者进行了独立实验。通过免疫沉淀实验和免疫共沉淀实验，研究者发现阳性对照SLC1A3和SLC4A7可以有效地结合SNX27，但没有检测到SNX27与AMPA受体亚基GluA1/2/3/4的相互结合。因此，这些数据再一次证实了AMPA受体的PDZ结合基序缺乏与SNX27高亲和力结合所需的最佳序列，同时也验证了蛋白质组学数据的可信性。
为了进一步寻找介导SNX27和AMPA受体相互作用的“桥梁”分子，作者又进一步分析了SNX27相互作用蛋白组。他们把目光集中在了一种参与突触聚集的分子，即亮氨酸富含重复序列和III型纤连蛋白结构域蛋白2 ，简称LRFN2。
LRFN家族，也称突触粘附样分子（SALMs），由5个单跨膜蛋白组成，LRFN1/2/3/4/5，每个蛋白都包含由6个亮氨酸富含重复序列（LRR）、一个免疫球蛋白（Ig）结构域和一个III型纤连蛋白结构域组成的的胞外区域，但不同的是，只有LRFN1、LRFN2和LRFN4的面向胞质的羧基端尾部含有I型PDZ结合基序。
采用免疫沉淀实验，研究者发现，只有含有PDZ结合基序的LRFN1、LRFN2和LRFN4才能与内源SNX27相结合，其中LRFN2与SNX27的相互作用依赖于LRFN2 PDZ结合基序羟基端的谷氨酸和缬氨酸。研究者采用等温滴定量热法也证明了SNX27 PDZ结构域与LRFN2 PDZ结合基元直接结合。这些数据表明，LRFN2通过其羧基末端的PDZ结合基元直接与SNX27的PDZ结构域结合。
SNX27和LRFN2的结合发挥什么样的作用呢？是否与SNX27介导的膜运输有关呢？激光共聚焦显微镜检显示，内涵体相关的SNX27与LRFN2共定位于整个大鼠原代海马神经元，包括树突和细胞体。SNX27被敲降后导致整个细胞中LRFN2水平的显著降低。不仅如此，SNX27被敲降后也导致细胞表面GluA1、GluA2和LRFN2水平的下降。进一步研究发现，SNX27的抑制会使LRFN2更多地进入溶酶体途径。这些数据表明，作为一个整合蛋白，LRFN2需要通过SNX27介导的膜运输循环机制回到细胞表面，换言之，整合蛋白LRFN2的膜转运依赖于SNX27。
对于LRFN2，研究主要关注其聚集NMDA受体的能力。那么LRFN2是否也调节AMPA受体的运输呢？免疫荧光实验表明，在神经元树突，LRFN2与GluA1、GluA2有共定位。采用免疫沉淀检测发现LRFN1、LRFN2和LRFN4可以与GluA1、GluA2相结合，并且，LRFN2主要通过其胞外的LRR结构域和Ig结构域介导与GluA1、GluA2的结合。SNX27敲降导致细胞表面GluA1和GluA2水平的下降，而LRFN2敲降只有导致GluA2水平的下降。当LRFN2或SNX27被抑制后，GluA2内吞增加，进入内涵体和溶酶体。这些数据表明SNX27或LRFN2的抑制扰乱了GluA2的循环，增加了其在溶酶体系统中的滞留时间。总之，一切证据表明，AMPA受体亚基GluA2依赖SNX27的膜转运，也与LRFN2之间存在特定的生化和功能联系。
最后，从功能上，离体切片电生理实验表明，在大鼠海马中，抑制SNX27和LRFN2均显著降低了兴奋性突触传递，抑制LRFN2比抑制SNX27更明显降低了谷氨酸能突触传递；其次LRFN2抑制会略减缓海马长时程突触增（LTP）的诱发。之前已经有研究表明SNX27抑制会损坏海马LTP的诱发【8】。LTP被普遍视为是构成学习与记忆基础的主要分子机制之一。
文章模式图：分选蛋白SNX27通过突触粘附蛋白LRFN2调控AMPA受体的转运
（图引自：McMillan, Banks, et al. eLife 2021;10: e59432 ）
原文链接：https://doi.org/10.7554/eLife.59432
【2】EMBO J︱神经元Miro1蛋白缺失破坏线粒体自噬并过度激活整合应激反应
【3】Science前沿综述解读︱烟碱型乙酰胆碱受体辅助分子的调节机制及疾病治疗转化应用前景
【4】Cereb Cortex︱催产素可调节大脑早期面孔区对面孔身份的个体化加工及对面孔种族的分类加工
【5】Nat Commun | 齐鑫课题组揭示化合物CHIR99021通过调节线粒体功能来治疗亨廷顿氏舞蹈病的分子机制
【6】Cereb Cortex︱库逸轩团队揭示工作记忆的同侧感觉皮层表征模式
【7】Neurosci Bull︱突触相关蛋白Dlg1通过抑制小胶质细胞激活改善小鼠抑郁样行为
【8】Brain | 首次！PAX6或许是阿尔茨海默病发病机制的关键因子及新治疗靶点
【9】Sci Adv︱重磅！DNA甲基化蛋白DNMT1突变可诱发神经退行性疾病
【10】Cell︱新发现！中脑调控运动现象对帕金森病治疗的新启示
【11】Cereb Cortex︱MET酪氨酸激酶信号转导时序异常是影响小鼠正常皮层神经回路发育和行为的关键机制
【12】Nat Biomed Eng︱叶玉如院士团队开发全脑基因编辑介导治疗阿尔茨海默症的新策略
【13】骆利群Science重磅综述系统解读︱神经环路结构——使大脑“计算机”高速运转的系统
【2】单细胞测序数据分析与课题设计网络实操班 (10月16-17日)
【3】JAMA Neurol︱注意！年轻人更容易患“老年痴呆”？
参考文献（上下滑动查看）
参考文献（上下滑动查看）
【1】Cullen PJ, Steinberg F. 2018. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews Molecular Cell Biology 19:679–696.
【2】Gallon M, Clairfeuille T, Steinberg F, Mas C, Ghai R, Sessions RB, Teasdale RD, Collins BM, Cullen PJ. 2014. A unique PDZ domain and arrestin-like fold interaction reveals mechanistic details of endocytic recycling by SNX27-retromer. PNAS 111:E3604–E3613.
【3】Steinberg F, Gallon M, Winfield M, Thomas EC, Bell AJ, Heesom KJ, Tavare ́ JM, Cullen PJ. 2013. A global analysis of SNX27-retromer assembly and cargo specificity reveals a function in glucose and metal ion transport. Nature Cell Biology 15:461–471.
【4】Cullen PJ. 2008. Endosomal sorting and signalling: an emerging role for sorting nexins. Nature Reviews Molecular Cell Biology 9:574–582.
【5】Lauffer BE, Melero C, Temkin P, Lei C, Hong W, Kortemme T, von Zastrow M. 2010. SNX27 mediates PDZ- directed sorting from endosomes to the plasma membrane. Journal of Cell Biology 190:565–574.
【6】Temkin P, Lauffer B, Ja ̈ ger S, Cimermancic P, Krogan NJ, von Zastrow M. 2011. SNX27 mediates retromer tubule entry and endosome-to-plasma membrane trafficking of signalling receptors. Nature Cell Biology 13:715–721.
【7】Clairfeuille T, Mas C, Chan AS, Yang Z, Tello-Lafoz M, Chandra M, Widagdo J, Kerr MC, Paul B, Me ́ rida I, Teasdale RD, Pavlos NJ, Anggono V, Collins BM. 2016. A molecular code for endosomal recycling of phosphorylated cargos by the SNX27-retromer complex. Nature Structural & Molecular Biology 23:921–932.
【8】Wang X, Zhao Y, Zhang X, Badie H, Zhou Y, Mu Y, Loo LS, Cai L, Thompson RC, Yang B, Chen Y, Johnson PF, Wu C, Bu G, Mobley WC, Zhang D, Gage FH, Ranscht B, Zhang YW, Lipton SA, et al. 2013. Loss of sorting nexin 27 contributes to excitatory synaptic dysfunction by modulating glutamate receptor recycling in down’s syndrome. Nature Medicine 19:473–480.
制版︱王思珍
本文完